Cryo-EM o Criomicroscopía electrónica

Autora: Lissy Z. F. Gross (lissy.gross@gmail.com)

Editores: Sergio Senin, Paola Guadalupe, David Cuaspud.

En el año 2017, el premio Nobel de química fue concedido a Jacques Dubochet, Joachim Frank y Richard Henderson “por el desarrollo de la crio microscopía electrónica para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas en solución” (The Nobel Prize, 2017). ¿Crio qué? No te preocupes, en este artículo vamos a aprender de forma simple de que se trata esta fascinante técnica que se considera que va a llevar la bioquímica e incluso la medicina a una nueva era.

Imagen 1: El año pasado tuve el placer de asistir en la Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA) a un seminario del Dr. Joachim Frank, uno de los 3 galardonados del premio Nobel de Química 2017 por Cryo-EM. Foto de Lissy Gross

Hace un tiempo hablamos en uno de nuestros podcasts sobre la importancia de conocer la estructura de las proteínas para poder entender su función. Si aún no lo escuchaste, puedes encontrarlo aquí: https://open.spotify.com/episode/0qeIDu5T7t7XjxdF6EDV6v?si=u8GfvD3XQSGgJRuyz4jwTA. La rama de la ciencia que se dedica a estudiar la estructura de las proteínas y de otras biomoléculas, es la Biología Estructural. En el podcast nos centramos en hablar de cristalografía de rayos X, que desde el siglo pasado ha sido la principal técnica utilizada para conocer la estructura de biomoléculas. Sin embargo, obtener un cristal de una biomolécula no siempre es algo fácil, a veces es incluso imposible, sobre todo cuando se quiere estudiar partículas más grandes como virus enteros o grandes complejos proteicos. Las proteínas envueltas de lípidos, como las que se encuentran en la membrana de las células, también son difíciles de estudiar mediante cristalografía.

La criomicroscopía electrónica (o cryo-EM de su nombre en inglés, Cryogenic electron microscopy) es otra técnica que permite estudiar la estructura de moléculas biológicas, con la ventaja de que, al tener un funcionamiento muy distinto a la cristalografía de rayos X, permite sortear todas las dificultades de obtener un cristal, así como también permite estudiar biomoléculas de gran tamaño.

Si bien se trata de una tecnología relativamente nueva, ya se han logrado avances increíbles con ella. Algunos ejemplos son la obtención de la estructura entera detallada del virus de Zika (Sihori et al, 2016), o más recientemente, la proteína Spike de SARS-CoV-2 (Wrapp et al, 2020), así como también del receptor humano ACE2 al que se une el Coronavirus para ingresar a nuestras células (Yan et al, 2020).

Imagen 2: Estructura del virus de Zika, obtenida mediante cryo-EM por Sihori et al., tomada de RSCB.PDB (izquierda). Estructura de la proteína Spike de SARS-CoV-2, obtenida en tiempo récord por Wrapp et al. (derecha).

¿Cómo funciona? Bueno, el primer paso consiste en preparar una muestra muy pura de proteína, o de la biomolécula que quiero estudiar. Esta muestra se va a encontrar en un buffer, o solución amortiguadora de pH, cuyo principal componente es agua. La muestra se va a congelar en etano líquido (¡aproximadamente a -180°C!), lo cual permite la formación del así llamado hielo vítreo, debido a que el congelamiento es casi instantáneo. Este hielo es especial porque tiene una estructura amorfa, es decir que las moléculas de agua no se ordenan en cristales de hielo como los que conocemos de los copos de nieve, que dañarían la muestra, sino que se acomodan de forma desordenada y se amoldan a las partículas de proteína o de la biomolécula que quiero estudiar. Esto mantiene las partículas en su forma natural y en una capa muy fina de hielo vítreo (CNRS, 2018), por lo cual, esta es la parte “cryo” de cryo-EM.

Luego, estas muestras congeladas se las coloca en un microscopio electrónico (la parte EM, o Electron Microscopy, de cryo-EM) para estudiarlas. Un microscopio electrónico, a diferencia de un microscopio óptico, utiliza un haz de electrones en vez de fotones para poder “observar” las partículas biológicas. Los electrones atraviesan la muestra congelada y son detectados por una cámara. El hielo vítreo protege a las biomoléculas y retarda los daños causados por los electrones, que al chocar con las partículas de la muestra le transfieren tanta energía que rompen parte de su estructura (CNRS, 2018).

El microscopio electrónico va a tomar entonces miles de imágenes de esta muestra. Sin embargo, estas imágenes son 2D… ¿cómo obtengo un modelo 3D a partir de ellas? Acá vamos a necesitar ayuda de la computación. Al momento de congelar mi muestra, las proteínas o biomoléculas se encuentran en un buffer moviéndose libremente, por lo que cada una se va a congelar abruptamente en la orientación que estaba en ese momento. En las imágenes del microscopio vamos a poder distinguir partículas en muchas orientaciones distintas. Se lo pueden imaginar como un fotógrafo tomando varias fotos de una bailarina girando sobre su propio eje. Gracias a ciertos algoritmos de procesamiento de imágenes, las distintas orientaciones se distinguen y clasifican entre sí. Luego, otro software toma las distintas caras u orientaciones 2D de la partícula y crea con eso un modelo 3D de la proteína o biomolécula de interés. Es decir, a partir de todas las fotos de la bailarina girando, puedo reconstruir un modelo 3D de ella.

Imagen 3: Flujo de trabajo en cryo-EM — la muestra se coloca en una cuadrícula, se congela y se mide en el microscopio electrónico. Luego, mediante softwares especiales, se eligen y clasifican las partículas 2D para luego armar un modelo 3D final que representa la biomolécula bajo estudio. Imagen de Creative Biostructure

Vale la pena destacar que cryo-EM, al igual que otras técnicas de Biología estructural, requieren del trabajo conjunto entre químicos, físicos, bioquímicos, biólogos, programadores, etc, lo cual demuestra las maravillas científicas que se pueden lograr si las distintas ciencias trabajan de forma conjunta e interdisciplinaria (CNRS, 2018).

Hoy en día la criomicroscopía electrónica y la cristalografía de rayos X se usan muchas veces como técnicas complementarias. Si bien las estructuras que se obtienen con cryo-EM son la mayoría de las veces de mucha menor resolución a las estructuras cristalinas, se está mejorando la técnica a un paso impresionante. Y su uso está revolucionando el estudio de las grandes máquinas moleculares resistentes a cristalizar. Tanto es así, que se cree que en algunos años podría destronar a la cristalografía del lugar preferencial que ha ocupado desde hace casi un siglo (Callaway, 2015; Callaway, 2020).

Figura 3: Se observa claramente la gran mejoría en resolución que hubo desde 2013 a la actualidad, que permite resolver las estructuras a nivel atómico. Illustration by Martin Högbom/The Royal Swedish Academy of Science

Sin embargo, cryo-EM es aún una técnica muy costosa y de acceso limitado a la mayoría de los científicos. Si bien hay muchos incentivos y programas que buscan ampliar su uso, lo cierto es que hoy en día, al menos para Latinoamérica, sigue siendo una técnica casi inalcanzable. Un equipo puede costar entre 5 a 7 millones de dólares y el único país de Latinoamérica en donde se puede hacer cryo-EM es Brasil, en el Brazilian Nanotechnology National Laboratory (LNNano) en Campinas. La buena noticia es que su uso para la comunidad científica es gratuito. (Tachibana, 2020).

No cabe dudas de que cryo-EM llegó para revolucionar la Biología Estructural y que nos va a permitir resolver aún más misterios de la Biomedicina. Sin embargo, el próximo gran desafío va a ser lograr un uso más democrático y de mayor acceso a las masas. “Necesitamos un cryo-EM de la gente” (Hand et al, 2020).

Referencias:

The Nobel Prize (2017), The Nobel Prize in Chemistry 2017, Nobelprize.org, https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2017/advanced-information/

Sirohi, D., Chen, Z., Sun, L., Klose, T., Pierson, T. C., Rossmann, M. G., & Kuhn, R. J. (2016). The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science (New York, N.Y.), 352(6284), 467–470. https://doi.org/10.1126/science.aaf5316

Wrapp, D., Wang, N., Corbett, K. S., Goldsmith, J. A., Hsieh, C. L., Abiona, O., Graham, B. S., & McLellan, J. S. (2020). Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science (New York, N.Y.), 367(6483), 1260–1263. https://doi.org/10.1126/science.abb2507

Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., & Zhou, Q. (2020). Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science (New York, N.Y.), 367(6485), 1444–1448. https://doi.org/10.1126/science.abb2762

CNRS (2018), Cryogenic Electron Microscopy Explained, CNRS News, https://news.cnrs.fr/videos/cryogenic-electron-microscopy-explained

Callaway, E. (2015), The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology, Nature News, https://www.nature.com/news/the-revolution-will-not-be-crystallized-a-new-method-sweeps-through-structural-biology-1.18335

Callaway, E. (2020), Revolutionary cryo-EM is taking over structural biology, Nature News, https://www.nature.com/articles/d41586-020-00341-9

Tachibana, C. (2020), Democratizing cryo-EM: Broadening access to an expanding field, Science Magazine News, https://www.sciencemag.org/features/2020/03/democratizing-cryo-em-broadening-access-expanding-field

Hand, E. (2020), ‘We need a people’s cryo-EM.’ Scientists hope to bring revolutionary microscope to the masses, Science Magazine News, https://www.sciencemag.org/news/2020/01/we-need-people-s-cryo-em-scientists-hope-bring-revolutionary-microscope-masses