Cromatografía de proteínas

¿Cómo obtenemos proteína pura para nuestros experimentos?

Autora: Lissy Z. F. Gross

Editores: Sergio Senin, Samantha Vargas, David Cuaspud.

Las proteínas son las máquinas moleculares que llevan a cabo todas las reacciones bioquímicas que ocurren en nuestro cuerpo. Cuando queremos estudiarlas y aprender sobre ellas (por ejemplo, para saber por qué funcionan mal y causan en consecuencia alguna enfermedad) muchas veces necesitamos producirlas y purificarlas para luego utilizarlas en diferentes ensayos.

¿Cómo se producen? No hablaremos de eso en este artículo, pero a grandes rasgos se obtienen mediante ingeniería genética insertando el gen de la proteína de interés en algún huésped que la produzca en grandes cantidades, que pueden ser bacterias, levaduras, células de mamífero, células de insecto, plantas e incluso animales (Structural Genomics Consortium et al. 2008). Este tipo de proteínas se denominan proteínas recombinantes, y muchas veces se les agrega sitios de corte y tags para la posterior estrategia de purificación. Los tags son pequeñas secuencias que permiten “marcar” a las proteínas de interés para luego poder diferenciarlas y separarlas de todo el resto de proteínas que existen en la célula del organismo huésped que estamos usando para producirlas (Marintcheva, 2008).

¿Y para qué necesitamos proteínas puras? Muchas de las técnicas que se usan para estudiarlas necesitan que la muestra no esté contaminada con otras proteínas que no nos interesan, ya que pueden llegar a interferir. Algunos ejemplos son:

• Ensayos cinéticos y de actividad: para saber cómo funcionan y a qué velocidad las enzimas, que son un tipo particular de proteínas.
• Ensayos de interacción proteína-proteína: para saber con qué otras proteínas o moléculas se une.
• La mayoría de las técnicas de biología estructural y biofísica: RMN, cristalografía de rayos X, CryoEM, SAXS, dicroísmo circular entre otras se usan para comprender como es la estructura tridimensional de la proteína.

Entonces, ¿cómo hacemos para purificar proteínas? Utilizamos una técnica que se llama cromatografía de proteínas. La cromatografía es una técnica física que permite separar a partir de mezclas complejas, los distintos componentes aislados, permitiendo identificar y cuantificar muchas veces cada uno de estos componentes (Coskun, 2016). Consiste en una fase estacionaria, que puede ser un sólido (como la sílica) o un líquido adsorbido sobre un soporte sólido, y una fase móvil, que puede tratarse de un líquido o un gas. El principio se basa en colocar la mezcla a separar en una fase móvil, y dejar que fluya a través de una columna que contiene la fase estacionaria. Los distintos componentes de la mezcla van a interaccionar de distinta forma con la fase estacionaria dependiendo de su tamaño o sus propiedades fisicoquímicas como su carga o hidrofobicidad (que tan afín es por el agua) (Khan Academy). Aquellas que interaccionen más, tardarán más en eluir, es decir salir de la columna. Por el contrario, aquellas partículas que no interaccionen tanto, eluirán mucho más rápido que el resto. Esto permite separar las distintas partículas o componentes entre sí, ya que en la medida que vayan eluyendo, se colectarán a la salida de la columna cada una de ellas por separado.

Figura 1: Ilustración de una cromatografía donde se indica la fase móvil y estacionaria, así como la posterior separación de los analitos (muestras a analizar)

Veamos cómo podemos explicarlo de una forma no tan técnica: imaginemos que tenemos una peatonal con gente de dos grupos etarios: niños y adultos. El objetivo es que al finalizar la peatonal, salgan caminando ambos grupos de forma separada. La peatonal va a tener muchos locales y negocios, que van a ser la fase estacionaria. Si la peatonal está por ejemplo llena de jugueterías, los niños van a querer entrar en ellas a medida que caminan por la peatonal (van a interaccionar con la fase estacionaria), por lo que tardarán mucho más en llegar al final de la peatonal. En cambio, los adultos, no van a mostrar interés en vidrieras con juguetes, por lo que seguirán caminando de largo y llegarán primero, antes que los niños, al final de la peatonal. De esta forma, al final del recorrido, pude separar ambos grupos etarios.

Figura 2: ejemplo ilustrativo del principio de separación mediante cromatografía. La mezcla inicial (violeta) se va a separar en sus componentes (azul y rojo) los cuales van a eluir de la columna en distintos tiempos y podrán ser colectados en tubos distintos. Tomada de http://biomodel.uah.es/

Existen muchos tipos distintos de cromatografías, acá mencionaremos las más utilizadas para purificar proteínas (Khan Academy, Ritchie 2012):

Exclusión molecular: Se basa en separar las proteínas según su tamaño. La fase estacionaria consiste en unas bolillas porosas de un material llamado sílica. Las proteínas más pequeñas van a ingresar en los poros de las bolillas y por lo tanto van a tardar más tiempo en eluir. Mientras que las proteínas grandes van a fluir entremedio de las bolillas sin quedarse atrapadas en los poros y van a eluir primero. En este tipo de cromatografía no hay ningún tipo de interacción física o química entre el analito (lo que quiero separar) y la fase estacionaria.

Intercambio iónico: En este tipo de cromatografía se utiliza una fase estacionaria con carga, ya sea positiva o negativa. Como las proteínas son biomoléculas que tienen cargas en su superficie, aquellas que tengan la carga opuesta a la resina, se verán atraídas por interacciones electrostáticas, lo cual hará que tarden mucho más en eluir. Por el contrario, aquellas proteínas que tengan igual carga que la resina, se verán repelidas por la fase estacionaria, y eluirán antes de la columna. Las interacciones electrostáticas son justamente las fuerzas de atracción o repulsión entre objetos con carga eléctrica.

Interacción hidrofóbica: En este caso la fase estacionaria es hidrofóbica, es decir que tiene unidos grupos químicos que repelen el agua, y les gusta unirse a otras moléculas hidrofóbicas como ellas. Por lo tanto, aquellas proteínas con características más hidrofóbicas van a interaccionar con la fase estacionaria y eluirán al final, mientras que aquellas proteínas hidrofílicas (lo opuesto a hidrofóbico), van a preferir seguir interaccionando con el agua de la fase móvil y van a salir primero.

Afinidad: Este tipo de cromatografía se basa en interacciones químicas y bioquímicas de mucha afinidad. Por lo tanto, la fase estacionaria suele contener algo que se une con mucha atracción a mi proteína de interés. Por ejemplo, si yo estoy purificando una proteína A, mi fase estacionaria va a estar cubierta con anticuerpos anti A, que van a unirse de forma muy específica a la proteína y la van a retener. Por lo general en estas cromatografías se pasa la mezcla por la columna, se deja que se una nuestra proteína de interés, se lava muchas veces la columna para sacarse de encima todas las otras proteínas contaminantes, y finalmente se agrega algo que rompe la unión entre la fase estacionaria y mi proteína de interés, permitiendo que eluya pura. Para este tipo de cromatografía se suelen agregar a las proteínas recombinantes los así llamados “tags”, ya que existen fases estacionarias especiales que unen con mucha afinidad cada uno de ellos. Algunos ejemplos son el tag de 6 u 8 histidinas (His-tag) para que las proteínas se unan a resinas de Níquel o el tag de biotina, que es una molécula que se une de forma muy fuerte a otra molécula llamada avidina, la cual es la que va a estar en la fase estacionaria.

Figura 2: Ilustración de la cromatografía de afinidad, de intercambio iónico y de exclusión molecular, con el fundamento de cada una. Tomada de http://thebumblingbiochemist.com/

Purificar una proteína no es algo rápido ni simple, y por lo general se combinan varias cromatografías distintas en cierto orden para lograr obtener finalmente la proteína de interés pura. Esto muchas veces suele llevar varios días, a pesar de que hoy en día ya existen algunos equipos más automatizados que facilitan algunos de los pasos, como el FPLC (fast protein liquid chromatography o cromatografía líquida rápida de proteínas). De todas formas, a pesar de ser un proceso largo (y muchas veces frustrante por las muchas cosas que pueden salir mal), el resultado final lo merece.

Gracias a la cromatografía no solo se ha podido tener muestras de proteínas ultrapuras que han permitido hacer grandes descubrimientos al estudiarlas, sino que es una técnica fundamental en la industria farmacéutica: no solo se la utiliza para purificar proteínas inyectables como la insulina, sino que también es parte del proceso de producción de vacunas y medicamentos. También se la utiliza mucho en la industria química, alimenticia y del petróleo, como también en estudios ambientales, toxicológicos, forenses, clínicos, etc. (Sgariglia et al. 2010). Sin dudas, el mundo que conocemos no sería el mismo sin la cromatografía.

Referencias:

Sgariglia et al. (2010). FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES UNT, ISSN 1853‐3337, Revista Arakuku (2010) ‐ Año 2 ‐ Número 1 (1–6), https://ri.conicet.gov.ar/bitstream/handle/11336/75465/CONICET_Digital_Nro.3655a360-b03b-44c8-8519-bc747d073f7c_A.pdf?sequence=2&isAllowed=y

Khan Academy, Principles of chromatography, khanacademy.org, https://www.khanacademy.org/science/class-11-chemistry-india/xfbb6cb8fc2bd00c8:in-in-organic-chemistry-some-basic-principles-and-techniques/xfbb6cb8fc2bd00c8:in-in-methods-of-purification-of-organic-compounds/a/principles-of-chromatography

Ritchie (2012). Protein purification, MATER METHODS 2012;2:134, //dx.doi.org/10.13070/mm.en.2.134

Structural Genomics Consortium, China Structural Genomics Consortium, Northeast Structural Genomics Consortium, Gräslund, S., Nordlund, P., Weigelt, J., Hallberg, B. M., Bray, J., Gileadi, O., Knapp, S., Oppermann, U., Arrowsmith, C., Hui, R., Ming, J., dhe-Paganon, S., Park, H. W., Savchenko, A., Yee, A., Edwards, A., Vincentelli, R., … Gunsalus, K. C. (2008). Protein production and purification. Nature methods, 5(2), 135–146. https://doi.org/10.1038/nmeth.f.202

Marintcheva, (2008). Chapter 4 — Viral Tools for Protein Expression and Purification, Harnessing the Power of Viruses 2018, Pages 103–131, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810514-6.00004-0

Coskun O. (2016). Separation techniques: Chromatography. Northern clinics of Istanbul, 3(2), 156–160. https://doi.org/10.14744/nci.2016.32757